Metodą, która ma pozwolić na indywidualne podejście do pacjenta, jest analiza jego genomu. Genom to zapisane w formie chemicznej podstawowe informacje dotyczące budowy i funkcjonowania naszego ciała. Informacja ta jest zakodowana w kolejności występowania w łańcuchu kwasu deoksynukleinowego (DNA) czterech liter kodu genetycznego (nukleotydów) - A,C,G,T (sekwencja) i zapakowana wraz z tzw. śmieciowym DNA (który stanowi ponad 98% naszego materiału genetycznego) w 23 pary chromosomów. Razem jest to 6 mld (2 x 3 mld) liter kodu. Informacja, którą w tej chwili potrafimy odczytać, zrozumieć i zinterpretować dotyczy około 23 000 genów. Każdy gen zawiera informacje pozwalające organizmowi na wyprodukowanie jednej z 23 000 cząsteczek - białek, enzymów lub RNA składających się na nasze ciało. Wiekszosc genów (z wyjatkiem tych zlokalizowanych na chromosomie Y u męzczyzn) jest zduplikowana - połowę otrzymujemy od matki, połowę od ojca.
Błędy genetyczne
Błędy w kopiowaniu tego oprogramowania zarówno te ktore przydarzyly sie naszym przodkom (mutacje dziedziczne) jak i te powstale w trakcie naszego rozwoju zarodkowego (mutacje de novo) wmogą prowadzić do mniej lub bardziej poważnych uszkodzeń metabolizmu, poczynając od nietolerancji laktozy do bardzo poważnych schorzeń, takich jak mukowiscydoza czy dystrofia mięśniowa lub też wręcz do natychmiastowego obumarcia zarodka. Problemy pojawiają się najczęściej, gdy obie kopie genów są uszkodzone. W chwili obecnej znamy 6500 genów, których uszkodzenia mogą powodować choroby W zdecydowanej wiekszosci przypadkow uszkodzenie dotyczy tylko jednej kopi genu i wtedy zyskujemy status "nosiciela" mutacji i raczej nie rozwiniemy objawów choroby.
Problem zaczyna sie wtedy gdy dwoje nosicieli mutacji w tych samych genach zapragnie miec potomka...
Problem genetycznych chorób rzadkich dotyczy prawie 2 mln Polaków. Statystycznie genom każdego z nas zawiera 8 takich poważnych błędów. I każdy z nich może spowodować na przykład naszą indywidualną reakcję na podane lekarstwa.
Przykładem jak mutacje wplywaja na nasza indywidualna reakcje na leki (farmakogenetyka) jest naglosniona w prasie sprawa kodeiny. Kodeina powszechnie stosowana od wielu lat musi zostać zamieniona w wątrobie na morfinę, aby mogła uwolnić nas od bólu. Niestety, ze względu na różne warianty genu CYP2D6, niektórzy ludzie dokonują tej zamiany tak szybko, że umierają na skutek zatrucia morfiną (dotyczy to 1% Azjatów, 1-10% osób rasy kaukaskiej i 16-28% mieszkańców Afryki), z drugiej strony dla 6-10% osób rasy kaukaskiej, posiadających inny wariant genu, metabolizm jest tak powolny, że lek ten właściwie nie ma efektu terapeutycznego.
Sekwencjonowanie DNA
Jak uzyskać informację dotyczącą genomu? Czyli - jak przepisać kolejność 6 mld nukleotydów z cząsteczki związku chemicznego – DNA, opisanego w 1953 roku przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka, na prosty zapis literowy? Po raz pierwszy receptę (a nawet dwie) na taką przemianę podano w 1977 roku. Metoda chemiczna, opisana przez Allana Maxama i Waltera Gilberta, została wyparta przez metodę enzymatyczna, wymyśloną przez Fredericka Sangera. Bazując na metodzie Sangera, zmodyfikowanej o użycie barwników fluorescencyjnych, lasera i robota, zbudowano automaty do sekwencjonowania DNA pierwszej generacji. Za pomocą tych maszyn została po raz pierwszy ustalona sekwencja genomu człowieka. Powstało kilkanaście modeli maszyn pierwszej generacji różnych firm, ale to maszyny firmy Applied Biosystems (obecnie Life Technologies) w ciągu ostatnich 10 lat zdominowały rynek (w ponad 90%) i na tych maszynach - zwłaszcza na flagowym ABI 3730xl - wykonano lwią część wszystkich projektów sekwencjonowania na całym świecie.
Kilkaset takich maszyn pracowało przez kilka lat, aby odczytać genom. Koszt przedsięwzięcia wyniósł 3 mld dolarów. Aby przygotować DNA do odczytania, należało przedtem powielić osobno każdy fragment DNA wiele milionów razy, aby uzyskać kilka mikrogramów tzw. matrycy i wyznakować ją barwnikiem fluorescencyjnym. Powielanie DNA (reakcja łańcuchowa polimerazy, PCR) i znakowanie odbywa się w termocyklerach. W projekcie sekwencjonowania pracowało kilkaset termocyklerów.
Wyścig technologiczny
Rozpoczęty w 1990 roku przez amerykański Department of Energy (DOE) we współpracy z National Institute of Health (NIH), Human Genome Project (HGP) oficjalnie został zakończony w 2004 roku. Poczynając od 2000 roku ekipy związane z HGP publikowały kolejne, pełne sekwencje pojedynczych chromosomów. Datę 18 maja 2006 roku, kiedy to wykonano pełną sekwencję chromosomu, należy uznać za moment zakończenia projektu. Identyfikacja wszystkich genów człowieka, dająca wyobrażenie o potencjalnych możliwościach diagnostyki i profilaktyki, spowodowała wyścig technologiczny.
W latach 1990–2005 koszt ustalenia jednej zasady sekwencji spadł tysiąckrotnie, z 10$ do jednego centa. Za osiągnięcie końcowej ceny sekwencjonowania genomu człowieka -1000$ - ufundowane zostały dwie nagrody: 0,5 mln $ J.Craig Venter Science Foundation i 5,20 mln $ X Prize Foundation. Kilkanaście firm przystąpiło do technologicznego wyścigu. Główną stawką nie jest jednak pozyskanie grantu czy nagrody za obniżenie kosztów projektów naukowych. Walka trwa o pozyskanie olbrzymiego rynku przyszłości, rynku indywidualnej diagnostyki - podstawy spersonalizowanej medycyny. W chwili obecnej w wyścigu bierze udział około 10 firm.
Maszyny Drugiej i Trzeciej Generacji
W czerwcu 2007 roku podano wiadomość o zsekwencjonowaniu genomu Jamesa Watsona - odkrywcy struktury DNA. Odczytanie genomu Watsona trwało rok, kosztowało 1 mln $ i zostało wykonane za pomocą pierwszego sekwenatora genomowego opartego o metodę pirosekwencjonowania. Niestety, ze względu na ograniczenia technologiczne urządzenie nigdy nie będzie w stanie odczytać kompletnego genomu człowieka za jednym uruchomieniem.
Maszyną drugiej generacji, która osiągnęła szczyt możliwości jest Hiseq2000
Firmy Illumina. Odczytanie dwóch genomów zajmuje jej 5 dni, przy koszcie odczynnikowym 10 k$ za genom. Jednak jest to jeszcze za wolno i za drogo, aby można było myśleć o powszechnej spersonalizowanej medycynie.
Maszyny trzeciej generacji muszą być szybsze - uzyskanie sekwencji genomu w kilka godzin lub nawet minut powinno być standardem, oraz tańsze, jeśli chodzi o koszt jednorazowej analizy - 1000$ w tym przypadku wydaje się już ceną zbyt wygórowaną, powinno to być raczej 100- 200$. Ważną sprawą jest zestaw procedur przed uruchomieniem maszyny, czyli przygotowanie bibliotek fragmentów DNA i powielenie materiału do sekwencjonowania. Czułość istniejących urządzeń, pomimo zastosowania kamer o najwyższej czułości, jest niewystarczająca, aby odczytywać sekwencje bezpośrednio z pobranego materiału. Niestety, trzeba go wcześniej powielić (metodą tzw. emulsyjnego PCR), a to jest możliwe dopiero po stworzeniu bibliotek. Jest to praca żmudna i czasochłonna. Producenci urządzeń drugiej generacji nie przechwalają się ilością czasu niezbędną do przygotowania bibliotek, a procedura ta może trwać do 2 dni. Trzecia generacja maszyn obiecuje „single molecule sequencing” - czyli odczyt pojedynczej nici DNA bez konieczności czasochłonnego powielania materiału.
Maszyna, o której mówi się już od 3 lat jako o maszynie trzeciej generacji, jeszcze nie osiągnęła zakładanych parametrów. Firma Pacific Biosciences obiecuje sekwencjonowanie genomu człowieka w 15 minut przy koszcie kilkuset dolarów. Jest to technologia sekwencjonowania pojedynczej cząsteczki DNA w czasie rzeczywistym.
Testy genetyczne
Testy genetyczne były najprostszą i najtańszą (bez uwzględnienia praw patentowych) metodą wykrycia najbardziej rozpowszechnionych mutacji. Niestety, testy genetyczne pozwalaja na wykrycie tylko scisle okreslonych mutacji opisanych wczesniej w literaturze medycznej. W dużym skrócie - fragment genu, w którym chcemy wykryć mutację, jest powielany za pomocą metody PCR. Nastepnie dobierane sa enzymy restrykcyjne które przecinają powielony DNA tylko w określonym miejscu zdefiniowanym kolejnoscia nukleotydów. Jesli w analizowanym materiale kolejność nukleotydów zostanie zaburzona (na skutek mutacji) DNA nie zostanie przeciete , dając inny wzór prążków DNA po rozdziale w żelu agarozowym w polu elektrycznym. Jest to odpowiedź typu zerojedynkowego: czy dana mutacja występuje w badanym materiale genetycznym, czy też nie. Częstość występowania danej mutacji jest w wielu przypadkach charakterystyczna dla danej populacji. Sposób powielania DNA (użyte startery) czy tez przecinania (użyte enzymy restrykcyjne) podlegały opatentowaniu zamieniając tę prostą, niedokładną i tanią w wykonaniu metodę w bardzo kosztowną.
Test innolipa dla Genu CFTR wykrywa 36 najczestszych mutacji i kosztuje 500-800 PLN
Dla porownania stosujac metody sekwencjonowania w tej samej cenie mozna zbadac ponad 500 opisanych mutacji a dodatkowo znalezc nowe takie ktore nie zostaly jeszcze opisane
Chipy DNA
Najbardziej zaawansowaną technologią wykrywania juz znanych i opisanych mutacji jest technologia mikromacierzy (ang. microarrays). Zasada jej działania w dużym skrócie opiera się na zdolności do "rozpoznawania" przez cząsteczki DNA cząsteczek komplementarnych - A rozpoznaje T, a C rozpoznaje G i vice versa.
Interesujące nas fragmenty sekwencji genomowej (do kilku mln) są "przyklejone” do płytki nazywanej chipem. Chip DNA zalewany jest roztworem zawierającym badany DNA i w toku reakcji sygnał świadczący o rozpoznaniu lub braku rozpoznania identycznego fragmentu dla kilku milionów fragmentów jednocześnie jest przesyłany do komputera, w którym odbywa się przyporządkowanie wykrytej niezgodności do bazy wariantów genetycznych. Aktualnie dostępne mikromacierze pozwalają wykryć do 2 mln wariantów genetycznych (tzw. single nucleotide polymorhism, SNP), a w przygotowaniu są takie, które pozwolą na wykrycie do 5 mln SNP. Niestety metoda ta pozwala na wykrycie tylko uprzednio opisanych, uzyskanych poprzez sekwencjonowanie wariantów. Ostatnio zakończona część projektu sekwencjonowania 1000 genomów ludzkich zwiększyła liczbę rozpoznanych wariantów do 30 mln, a i to nie jest prawdopodobnie koniec. Zważywszy na fakt, że prawdopodobnie bardziej złożone choroby dziedziczne są efektem kombinacji rzadkich i aktualnie nabytych mutacji oraz cenę analizy opartej o mikromacierze, jest to raczej technologia, która swoje najlepsze lata ma już za sobą.
Obecne urządzenia do sekwencjonowania genomowego nie są i jeszcze długo nie będą prostymi automatami typu „wrzuć próbkę i odczytaj wynik”. Wymagają dużej wiedzy i praktyki z zakresu laboratorium biologii molekularnej. Jednak odczytanie genomu to dopiero początek problemu. Zamiana terabajtów uzyskanej informacji w wynik diagnostyczny służący profilaktyce lub leczeniu to zupełnie inny historia. Jest to problem, który może być rozwiązany jedynie w ścisłej współpracy bioinformatykow, diagnostow, biologów molekularnych i lekarzy genetyków.